Упп это: Полезные статьи — Wiseadvice-IT

Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в этом исследовании

Штаммы Escherichia coli выращивали в среде для инфузии мозга и сердца (BHI) (Difco) при 37 ° C с аэрацией. E. coli EC101 размножали в присутствии 40 мкг / мл канамицина. При необходимости добавляли Em и Cm до конечных концентраций 200 мкг / мл и 15 мкг / мл соответственно.

Выделение ДНК и манипуляции. Геномную ДНК L. acidophilus NCFM выделяли методом, описанным Уокером и Клаенхаммером (52), или с использованием набора для выделения микробной ДНК Mo Bio UltraClean (Mo Bio Laboratories, Карлсбад, Калифорния). Плазмидную ДНК из E. coli выделяли с использованием набора QIAprep Spin miniprep (Qiagen Inc., Валенсия, Калифорния). Рестрикционные ферменты (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) использовали в соответствии с инструкциями, предоставленными производителем. Лигирование ДНК выполняли с использованием ДНК-лигазы Т4 (New England Biolabs, Беверли, Массачусетс) или набора для лигирования ДНК Fast-Link (Epicenter Biotechnologies, Мэдисон, Висконсин) в соответствии с рекомендациями производителей. Праймеры для ПЦР (см. Таблицу S1 в дополнительном материале) были синтезированы Integrated DNA Technologies (Coralville, IA). Для клонирования ампликоны ПЦР были созданы с использованием ДНК-полимеразы PfuUltra II Fusion HS (Stratagene Corp., La Jolla, CA) в соответствии с инструкциями поставщика. Обычные ПЦР-амплификации для скрининга рекомбинантов выполняли с использованием стандартных протоколов и ДНК-полимеразы Choice- Taq Blue (Denville Scientific Inc., Метучен, Нью-Джерси). Продукты ПЦР анализировали на 0,8% агарозных гелях и очищали с использованием набора для выделения ДНК из геля Zymoclean (Zymo Research Corp., Orange, CA) или набора для экстракции из геля QIAquick (Qiagen). Секвенирование ДНК было выполнено Davis Sequencing, Inc. (Дэвис, Калифорния).

E.coli были получены химически компетентные клетки и трансформированы в соответствии с процедурами, ранее описанными Hanahan (27). Клетки L. acidophilus получали для электротрансформации, по существу, как описано Walker et al. (51) со следующими модификациями, адаптированными из процедуры Wei et al. (55). Вкратце, клетки стационарной фазы инокулировали в бульон MRS (2% инокулята) и выращивали в течение 3 часов (OD ₆₀₀ , ~ 0,1-0,2). Затем добавляли стерилизованный фильтром маточный раствор пенициллина G для получения конечной концентрации 10 мкг / мл, и культуру инкубировали в течение 1.За 5–2,0 ч до сбора урожая.

Конструирование мутанта с делецией upp . Чтобы сконструировать изогенный мутант Δ upp с внутренней делецией 315 п.н. в гене upp (LBA0770), сначала нужно выделить вышестоящий сегмент хромосомной ДНК (596 п.н.) и нижестоящий сегмент хромосомной ДНК (610 п.н.), фланкирующий область делеции, амплифицировали с помощью ПЦР с парами праймеров upp1U-F / upp2U-R и upp3D-F / upp4D-R (см. Таблицу S1 в дополнительном материале) соответственно. Два ПЦР-фрагмента очищали в геле и соединяли с помощью сплайсинга методом ПЦР с удлинением перекрытия (SOE-PCR) (28), где эквимолярные концентрации каждого продукта ПЦР (от 10 до 15 нг) объединяли и использовали в качестве матриц для амплификации в 50 мкл смеси для ПЦР с праймерами upp1U-F и upp4D-R.Все ПЦР проводили с 25-30 циклами амплификации, чтобы минимизировать накопление ошибок неправильного включения нуклеотидов в продукты ПЦР. Полученные продукты SOE-PCR очищали на геле, рестриктировали с помощью XbaI и SacI, лигировали в аналогично расщепленный вектор pORI19 и трансформировали в E. coli Dh20B, несущую плазмиду-помощник pTRK669 (NCK1391), с отбором на среде BHI, содержащей как Em, так и Cm. . Полученную рекомбинантную плазмиду pTRK934 электропорировали в L. acidophilus NCK1392.Процедуры, используемые для выделения свободных от плазмид рекомбинантов после хромосомной интеграции pTRK934 и рекомбинации с двойным кроссинговером, выполняли в основном, как описано ранее (19, 46). Делеции в рамке считывания в мутантах Δ upp подтверждали секвенированием ДНК продуктов ПЦР, полученных с парой праймеров upp-up / upp-dw (см. Таблицу S1 в дополнительном материале), специфичных для области, фланкирующей мишень для делеции. Анализ

PM. Эксперименты с фенотипическими микрочипами (PM) были выполнены Biolog Inc.(Хейворд, Калифорния). Технология PM основана на химической реакции между бактериями и тетразолиевым красителем. Если среда в лунке поддерживает рост бактерий, метаболизирующие клетки уменьшают количество тетразолия и дают цвет, который можно измерить с помощью прибора OmniLog в течение 24 часов. Информация о посевной среде и концентрации субстратов является частной собственностью (www.biolog.com ). В этом исследовании использовались двенадцать 96-луночных PM (от PM09 до PM20). Эти массивы использовались для следующих анализов: PM09, осмолиты; PM10, pH; и от PM11 до PM20, химическая чувствительность (см. таблицы S2 и S3 в дополнительном материале).Ночные культуры штаммов L. acidophilus ресуспендировали в бульоне MRS в соответствии с процедурами Biolog (www.biolog.com ) и добавляли в каждую лунку 12 96-луночных планшетов. При отрицательных реакциях цвет образуется незначительно или совсем отсутствует, тогда как цвет образуется при положительных реакциях. Инструмент OmniLog захватил цифровые изображения PM, файлы были впоследствии отображены в виде кинетических графиков для дыхания и роста, а программное обеспечение использовалось для расчета площади под кривой для каждого штамма.

Исследование экспрессии генов на микрочипах. (i) Создание ДНК-олигомассивов NCFM L. acidophilus . OligoArray 2.1 (45) использовали для конструирования олигонуклеотидов для конструирования олигонуклеотидных микрочипов NCFM (олигонуклеотидов). Диапазон используемых длин олигонуклеотидов составлял от 60 до 70 нуклеотидов, используемый диапазон температур плавления составлял от 80 до 96 ° C, а используемый диапазон содержания G + C составлял от 25 до 50% в зависимости от содержания G + C в геноме NCFM (34,71 %). Пороговые значения для отклонения олигонуклеотидов, которые могут образовывать стабильные вторичные структуры и возможной перекрестной гибридизации, составляли 65 ° C.Олигонуклеотиды, содержащие гомополимеры AAAAA, TTTTT, GGGGG, CCCCC или более длинные, были отклонены. Олигонуклеотиды были синтезированы Integrated DNA Technologies и нанесены на предметные стекла. Каждый олигонуклеотид (представляющий каждый ген) был нанесен шесть раз случайным образом.

(ii) Условия эксперимента и выделение РНК. Штамм NCFM дикого типа и изогенный мутант Δ upp выращивали в свежей среде MRS с использованием 2% инокулята из ночных культур. Аликвоты клеток собирали при OD ₆₀₀ , равном ∼0.3 (ранняя логарифмическая фаза) и 0,8 (средняя логарифмическая фаза) быстрым центрифугированием при комнатной температуре. Осадки клеток мгновенно замораживали на бане с сухим льдом и этанолом и хранили при -80 ° C. Образцы были собраны из двух независимых экспериментальных повторностей (представляющих две биологические повторности). Выделение общей РНК, обработку ДНКазой и очистку РНК выполняли в основном, как описано ранее (26). Отсутствие геномной ДНК в очищенных образцах РНК подтверждали проведением ПЦР с праймерами, специфичными для генов NCFM.

(iii) Синтез зонда кДНК и гибридизация олигомассивов. Обратную транскрипцию и флуоресцентное мечение идентичных количеств (20 мкг) очищенной РНК проводили с использованием системы непрямого мечения кДНК SuperScript для микроматриц ДНК (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) в соответствии с производителя, за исключением того, что 6 мкг случайных праймеров (Invitrogen) использовали для каждых 30 мкл реакционной смеси синтеза первой цепи кДНК. Меченые образцы кДНК, представляющие мутантные штаммы NCFM и Δ upp , были соединены с монореактивными красителями Cy3 и Cy5 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Пискатауэй, штат Нью-Джерси) соответственно. Сравнительную гибридизацию проводили с образцами, представляющими как NCFM, так и производное Δ upp на одних и тех же фазах роста. Перед гибридизацией слайды олигомассивов предварительно гибридизовали в буфере, содержащем 0,1% (вес / объем) додецилсульфата натрия (SDS) (Invitrogen), 0,1% (вес / объем) бычьего сывороточного альбумина (Invitrogen) и 5 ​​× SSC (1 × SSC представляет собой 0,15 М NaCl плюс 0,015 М цитрат натрия; Invitrogen) при 42 ° C в течение 1 ч, а затем промывают, погружая их пять раз в стерильную дистиллированную воду и дважды в изопропанол и сушат вращением.Попарно меченные Cy3 и Cy5 зонды сушили с помощью вакуумной системы Vacufuge speed (Epperdorf, Westbury, NY) и ресуспендировали в 48-50 мкл (общий объем) гибридизационного буфера, содержащего 5 × SSC, 5 × раствор Денхардта (Invitrogen). 30% (об. / Об.) Формамида, 0,1% SDS и 200 мкг / мл ДНК спермы лосося (Invitrogen). Полученные смеси зондов инкубировали при 95 ° C в течение 2 минут и гибридизовали с олигоанализаторами в течение 18-20 часов при 42 ° C. Матрицы после гибридизации сначала промывали предварительно нагретым (42 ° C) промывочным буфером, содержащим 1 × SSC и 0.03% SDS, а затем в промывочном буфере, содержащем 0,5 × SSC и 0,03% SDS, при комнатной температуре. Затем матрицы промывали 0,2 × SSC, после чего следовала заключительная промывка 0,05 × SSC. Каждый этап промывки длился 5 мин.

(iv) Сбор и анализ данных. Интенсивность флуоресценции регистрировали при разрешении 10 мкм на пиксель с помощью сканера микрочипов ScanArray 4000 (Packard Biochip BioScience; Biochip Technologies LLC) и сохраняли в виде файлов изображений TIFF. Была произведена количественная оценка интенсивности сигнала, вычиталось значение фона и данные были нормализованы с использованием QuantArray 3.0 (Packard Bioscience). Пятна анализировали с помощью адаптивного количественного анализа. Данные были нормализованы по медиане (7). Среднее соотношение Cy5 / Cy3 для 12 пятен для каждого гена (6 репликных пятен на слайд на биологический повтор) было определено и представляло изменение уровней экспрессии гена в мутанте Δ upp (Cy5) по сравнению со штаммом NCFM (Cy3). . Доверительные интервалы и значения P для изменения также были рассчитаны с использованием двухвыборочного теста t .Значения P ≤0,05 считались значимыми.

Конструирование вектора интеграции с возможностью обратного выбора. Для создания вектора интеграции с возможностью обратного выбора на основе pORI сайт множественного клонирования (MCS) вектора pORI28 был заменен кассетой экспрессии upp (P- upp ) и ген lacZ ‘( lacZ -альфа); Ген lacZ ‘был использован для сине-белого скрининга трансформантов E. coli посредством альфа-комплементации Δ lacZ ‘ E.coli клонирующие хозяева (рис. 1). Сначала ДНК плазмиды pORI28 расщепляли BglII и XbaI для удаления области MCS. Затем 5′-выступы рестриктированной плазмиды pORI28 заполняли с использованием ДНК-полимеразы PfuUltra II Fusion HS на основе протокола набора для полировки Stratagene PCR (Stratagene). Затем ген lacZ ‘с его промотором и сайтом связывания белка-активатора катаболита (CAP) амплифицировали из вектора pUC19 с парой праймеров pUC19lacZ-F / pUC19lacZ-R (см. Таблицу S1 в дополнительном материале) с использованием 10 нг ДНК вектора pUC19 в качестве матрицы для амплификации в 50 мкл реакционной смеси.Ген L. acidophilus NCFM upp с его предполагаемой промоторной областью амплифицировали с помощью ПЦР с парой праймеров upp-F / upp-R (см. Таблицу S1 в дополнительном материале). Оба очищенных ПЦР-ампликона были соединены с помощью SOE-PCR, как описано выше, с использованием пары праймеров pUC19lacZ-F / upp-R. Полученные продукты слияния lacZ ‘-P- upp лигировали в остов pORI28 с тупыми концами и трансформировали в E.coli NCK1391, и трансформанты отбирали на чашках со средой BHI, содержащих Em и Cm в присутствии X -Гал (5-бром-4-хлор-3-индолил-β-d-галактопиранозид) и изопропил-β-d-тиогалактопиранозид (IPTG). Положительные клоны выглядели как синие колонии из-за экспрессии гена lacZ ‘в рекомбинантной плазмиде. Полученный в результате противоселективный вектор интеграции, pTRK935, подвергали секвенированию ДНК для подтверждения целостности P- upp и MCS в гене lacZ ‘.

Построение вектора интегрирования с возможностью выбора счетчика pTRK935. ori , ориджин репликации pWV01; erm , ген, кодирующий устойчивость к Em; lacZ ‘, lacZ -alpha ген из pUC19; MCS, MCS из pUC19.Показаны только уникальные сайты ограничения.

Конструирование мутанта Δ slpX с использованием контрселективной системы замены гена. Делецию в рамке считывания длиной 1356 п.о. в гене slpX (LBA0512) конструировали путем первой амплификации сегментов ДНК длиной 767 п.о. и 747 п.о., фланкирующих восходящий поток. и нижележащие области мишени для делеции, соответственно, с использованием пар праймеров slpX1U-F / slpX2U-R и slpX3D-F / slpX4D-R (см. Таблицу S1 в дополнительном материале). Два очищенных продукта ПЦР были слиты и амплифицированы для создания копий аллеля Δ slpX методом SOE-PCR, как описано выше, расщеплены BamHI и SacI и лигированы в вектор интеграции pTRK935 с совместимыми концами.Смесь для лигирования трансформировали в E. coli EC101 с селекцией на среде BHI, содержащей канамицин, Em, X-Gal и IPTG. Полученную плазмиду, несущую аллель Δ slpX , pTRK936, электропорировали в штамм-хозяин L. acidophilus Δ upp , несущий pTRK669, NCK1910 (таблица 1). Один трансформант Em ^r Cm ^r , несущий обе плазмиды, выращивали в течение ночи в среде MRS, содержащей 2 мкг / мл Em и 2 мкг / мл Cm, и переносили три раза (1% инокулята) в среду MRS с Em (приблизительно.30 поколений) на водяной бане 42 ° C. Хромосомные интегранты отбирали путем посева реплик образцов на агар MRS с добавлением Em или Cm. Отбирали один интегрант Em ^r Cm ^s и размножали в среде MRS с Em при 37 ° C в течение ночи, после чего следовало от трех до пяти переносов (1% инокулята) в среду MRS без Em (примерно от 30 до 50 поколений). ). Культуры были серийно разведены, и от 10 ^-3 до 10 ^-4 разведений высевали на планшеты SDM с добавлением 5-ФУ и инкубировали при 37 ° C в анаэробных условиях в течение 48-72 ч до появления видимых колоний.Восемь колоний 5-FU ^r были отобраны для ПЦР-анализа области slpX с использованием праймеров slpX-up и slpX-dw (см. Таблицу S1 в дополнительном материале), которые специфически отжигаются с фланкирующей областью slpX . Делеции в рамке считывания подтверждали секвенированием ДНК, как описано выше.

Экстракция и очистка белков S-слоя. Культуры размножали в течение ночи в 100 мл среды MRS, и клетки собирали центрифугированием при 8000 × g в течение 20 минут при 4 ° C.Сухой вес осадка клеток из 100-мл культур составлял от 600 до 700 мг, что соответствует влажному весу от 5,4 до 6,3 г. После одной промывки холодной дистиллированной водой гранулы суспендировали в 5 M LiCl при соотношении 1 мл LiCl к 10 мг биомассы и инкубировали в течение 15 мин при 4 ° C при легком перемешивании. После центрифугирования супернатант (~ 60 мл) удаляли и диализовали в течение 24 часов против дистиллированной воды при 4 ° C с использованием мембраны Spectrapor 6-8000. Белый осадок, образовавшийся во время диализа, собирали центрифугированием при 40000 × g в течение 20 минут при 4 ° C.Для удаления белков, соосажденных с белком S-слоя, осадок ресуспендировали в 1 М LiCl и перемешивали в течение 15 мин при 4 ° C. После центрифугирования при 40000 × г в течение 20 минут при 4 ° C осадок промывали 15 мл холодной дистиллированной воды. Затем каждый осадок разделяли на две части, одну из которых использовали для прямого масс-спектрометрического (МС) анализа, а другую использовали для трипсинолиза и анализа лазерной десорбционной ионизации с использованием матрицы.

MS-анализ чистых белков S-слоя до и после трипсинолиза.Для прямого МС-анализа чистые белки S-слоя ресуспендировали в растворе, содержащем 50% (об. / Об.) Ацетонитрила и 4% (об. / Об.) Муравьиной кислоты в дистиллированной воде (общий объем, 500 мкл) в течение ночи при 4 ° C. Затем добавляли 200 мкл того же раствора ацетонитрил-муравьиной кислоты и смесь интенсивно перемешивали. Полная ресолюбилизация белкового осадка S-слоя никогда не наблюдалась; поэтому суспензию центрифугировали (12000 × г, , 10 мин, 4 ° C), супернатант удаляли и использовали для анализа МС.

Для снятия пептидных фингерпринтов чистые белки S-слоя (хранящиеся при -20 ° C) подвергали трипсинолизу. Расщепление трипсином S-слоя выполняли в течение ночи при 37 ° C и останавливали трифторуксусной кислотой (Sigma-Aldrich, St. Quentin-Fallavier, Франция). Затем супернатанты, содержащие пептиды, сушили с использованием вакуумной системы Speed ​​и хранили при -20 ° C до проведения анализа масс-спектрометрии.

MS. Все масс-спектры были получены с использованием гибридного квадрупольного времяпролетного масс-спектрометра (QStar XL; MDS Sciex, Торонто, Канада).Для экспериментов по лазерной десорбционной ионизации с использованием матрицы образцы ионизировали лазерным лучом (λ = 337 нм, 20 Гц), и фрагмент пептида β-казеина от остатка 193 до остатка 209 использовали в качестве калибровочного стандарта. Более характерные однозарядные ионы подвергались фрагментации с энергией столкновения от 50 до 90 кэВ.

Для экспериментов по ионизации электрораспылением к масс-спектрометру QStar XL подключили систему жидкостной нано-жидкостной хроматографии (LC-насадки; Dionex Voisins, Le Bretonneux, Франция).Масс-спектрометр работал в режиме положительных ионов. К источнику микроионов было приложено напряжение около 5 кВ. Данные МС и тандемной МС (МС / МС) получали в непрерывном режиме. Прибор был откалиброван с помощью многоточечной калибровки с использованием фрагментных ионов, которые возникли в результате индуцированного столкновением разложения фрагмента пептида β-казеина от остатка 193 до остатка 209. Для выполнения анализа МС / МС с двух- и трехзарядным предшественником использовался анализ, управляемый данными. ионы. МС / МС спектры были получены от m / z 50 до m / z 2000.Масс-спектрометр работал в режиме зависимости от данных автоматически с переключением между МС и МС / МС с использованием программного обеспечения Analyst QS 1. 1. Затем все данные (MS и MS / MS) были проанализированы с помощью MASCOT (v.2.1) для поиска в нескольких базах данных (MSDB и Интернет-база данных под названием «UMR») для идентификации белков, присутствующих в образцах.

Анализы с нагрузкой на стресс. Штаммы выращивали в бульоне MRS до OD ₆₀₀ от 0,25 до 0,3 (ранняя логарифмическая фаза) перед тем, как подвергать их использованным нагрузкам (7).Культуры делили на порции равного объема и собирали при комнатной температуре. Клетки ресуспендировали в равных объемах (i) бульона MRS с 0,3% (мас. / Об.) Свиной желчи (Sigma), (ii) бульона MRS с 2,5% (мас. / Об.) Бычьей желчи (Difco), (iii) бульона MRS с 10% (мас. / Об.) NaCl, (iv) бульон MRS с 15% (об. / Об.) Этанолом и (v) подкисленный бульон MRS при pH 3,5 (отрегулированный с помощью молочной кислоты) и pH 3,0 (отрегулированный с помощью HCl). Подсчет жизнеспособных клеток определяли через 2 часа инкубации при 37 ° C путем посева на среду MRS.Для анализов обработки SDS и Triton X-100 культуры с ранней логарифмической фазой инокулировали (1%, об. / Об.) В бульон MRS, содержащий 0,01% или 0,02% (мас. / Об.) SDS или 0,25% или 0,50% (об. / Об.). т.) Тритон Х-100. Рост оценивали путем определения OD ₆₀₀ после 24 ч инкубации при 37 ° C. Для испытания замораживанием-оттаиванием порции по 1 мл культур с ранней логарифмической фазой центрифугировали и ресуспендировали в равном объеме 0,1 × бульона MRS. Образцы подвергали многократным циклам замораживания (баня этанол-сухой лед, 3 мин) и оттаивания (водяная баня 37 ° C, 3 мин).Выживших оценивали путем посева на агар MRS после 5, 10, 15 и 20 циклов замораживания-оттаивания.

Анализ адгезии эпителиальных клеток Caco-2. Для анализа адгезии клеток Caco-2 клеточную линию Caco-2 (ATCC HTB-37) получали из Американской коллекции типовых культур (Роквилл, Мэриленд). Все среды для культивирования клеток и реагенты были приобретены у Gibco (Gibco-Invitrogen Corp., Карлсбад, Калифорния). Клетки Caco-2 получали и поддерживали для исследований адгезии, как описано ранее Buck et al. (20) со следующими модификациями.Вкратце, клетки обычно выращивали при 37 ° C в атмосфере 95% воздуха и 5% CO ₂ в минимальной необходимой среде с добавлением 1 мМ пирувата натрия, 20% (об. / Об.) Инактивированного нагреванием (56 ° C, 30%). мин) фетальная бычья сыворотка, 0,1 мМ заменимых аминокислот и антибиотики (100 мг / мл пенициллина G, 100 мг / мл сульфата стрептомицина и 0,25 мг / мл амфотерицина). Для анализа адгезии монослои готовили в 12-луночных планшетах для культивирования тканей путем засева приблизительно 6,5 × 10 ⁴ клеток на лунку 2 мл среды для культивирования клеток.Культуральную среду заменяли каждые 2 дня, и монослои использовали для анализа приверженности через 14-15 дней после контакта. Клетки использовали между пассажами 23 и 40. Перед анализами на адгезию монослои дважды промывали 1 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) (pH 7,4; Invitrogen), а затем к каждому добавляли 1 мл свежей культуральной среды без антибиотиков. хорошо.

Для приготовления бактериальных клеток 10 мл клеток средней логарифмической фазы (OD ₆₀₀ , 0,6–0,8), выращенных в бульоне MRS, осаждали центрифугированием при 3,166 × г в течение 10 мин при комнатной температуре, промывали один раз. с 10 мл PBS и ресуспендировали в PBS до конечной концентрации ~ 4 × 10 ⁸ КОЕ / мл.Один миллилитр бактериальной суспензии добавляли в каждую лунку, содержащую монослой Caco-2, и инкубировали при 37 ° C в течение 1 часа. После этой инкубации монослои промывали пять раз 1 мл PBS для удаления несвязавшихся бактерий, а затем инкубировали с 1 мл 0,05% (об. / Об.) Triton X-100 в течение 10 мин. Суспензии однослойных клеток и бактерий серийно разводили в 0,1 × бульоне MRS и высевали на агар MRS для определения количества прикрепившихся клеток (выраженных в КОЕ). Все эксперименты проводились по крайней мере с тремя независимыми культурами, каждая с трехкратной повторностью лунок, содержащих монослои.

Анализ адгезии муцина. Для иммобилизации муцина желудка свиньи (тип III; Sigma) на 96-луночном круглодонном планшете из полистирола Costar (Corning Inc., Нью-Йорк) использовали 10 мг / мл раствора муцина в дистиллированной воде. готовили, разливали в каждую лунку (100 мкл на лунку) и инкубировали при 4 ° C в течение ночи. Избыток муцина удаляли двумя промывками 200 мкл PBS перед добавлением бактериальных клеток. Культуры в средней логарифмической фазе, выращенные в бульоне MRS, один раз промывали PBS, и конечную OD ₆₀₀ доводили до 0.6 с PBS. Клеточную суспензию (100 мкл) добавляли в каждую лунку и инкубировали при 37 ° C в течение 1 часа. Затем каждую лунку пять раз промывали 200 мкл PBS для удаления несвязавшихся клеток, после чего следовала обработка 200 мкл 0,05% Triton X-100 для отделения слоя муцина и бактериальных клеток. Суспензию клеток разводили в 0,1 × бульоне MRS и высевали на агар MRS для определения количества прилипших клеток (выраженного в КОЕ). Все эксперименты проводились с двумя независимыми культурами, каждая из которых имела трехкратные лунки, содержащие слой муцина.

Анализ микробной адгезии к растворителям (MATS). Анализ микробной адгезии к растворителям (MATS) проводили на основе протокола, описанного Bellon-Fontaine et al. (12) со следующими двумя парами растворителей: (i) хлороформ (кислота Льюиса, акцептор электронов, полярный) и гексадекан (аполярный), и (ii) этилацетат (основание Льюиса, донор электронов, полярный) и декан (неполярный). ). Вкратце, 5-миллилитровые порции культур средней логарифмической фазы, выращенных в бульоне MRS, собирали центрифугированием при 3166 × г при комнатной температуре, промывали один раз в равном объеме PBS и ресуспендировали в PBS до конечной OD _400. из 0.8. Затем 1,2 мл каждой клеточной суспензии смешивали с 0,2 мл каждого растворителя путем встряхивания в течение 60 с. Смеси инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин, чтобы обеспечить полное разделение двух фаз. Затем 600 мкл водной фазы осторожно удаляли для определения OD ₄₀₀ . Уровень сродства клеток к растворителям рассчитывали по следующему уравнению:% аффинности = 100 × [1 — ( A / A ₀ )], где A ₀ и A являются OD ₄₀₀ суспензии клеток до и после смешивания с растворителями, соответственно.Все анализы были выполнены в двух экземплярах с двумя независимыми культурами.

Сканирующая электронная микроскопия (SEM). Клетки выращивали в среде MRS (14 мл) до OD ₆₀₀ от 0,6 до 0,8 (при этом pH супернатанта культуры составлял от ~ 5,1 до 5,3) и осаждали центрифугированием при 3166 × . g при комнатной температуре. Осадки клеток ресуспендировали в свежей фиксирующей смеси 1: 1 (об. / Об.), Содержащей 6% глутарового альдегида и 0,2 М какодилата натрия (pH 5,5), и хранили при 4 ° C. Обработка образцов для сканирующей электронной микроскопии (SEM) была выполнена Центром электронной микроскопии при Университете штата Северная Каролина.Образцы просматривали с помощью растрового электронного микроскопа JOEL JSM 5900LV при 15 кВ.

Номера доступа к данным микрочипов. Платформа микрочипов и данные серий доступны на сайте Gene Expression Omnibus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo ) под инвентарными номерами GPL7426 (платформа) и GSE14622 (серия).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Конструирование мутанта NCFM Δ upp в качестве хозяина для контрселективной аллельной замены. Чтобы исследовать потенциал контрселективной стратегии на основе upp для L.acidophilus NCFM, этот штамм впервые был протестирован для определения его чувствительности к 5-ФУ. Ночные культуры в бульоне MRS серийно разводили в SDM и высевали при плотности ок. 10 ⁵ КОЕ на чашку на SDM, содержащем различные концентрации 5-ФУ или эквивалентные количества ДМСО (агента, используемого для растворения 5-ФУ) в качестве контроля. Рост подавлялся на среде, содержащей 100 мкг / мл 5-ФУ. Присутствие ДМСО в среде не влияло на рост L. acidophilus , указывая на то, что ингибирование роста было обусловлено исключительно токсичностью 5-ФУ.Следовательно, 100 мкг / мл 5-ФУ было приемлемой концентрацией для отбора против интегрантов, которые не разрешили меродиплоидное состояние.

Чувствительность L. acidophilus к 5-ФУ подтвердила присутствие функциональной UPRTase. Предполагаемый ген, кодирующий UPRTase, LBA0770, был обнаружен в последовательности генома NCFM. Кодирующая область LBA0770 была аннотирована как upp на основании сходства последовательностей с соответствующими ферментами в базе данных GenBank. Выведенная аминокислотная последовательность показала более 80% идентичности последовательности с UPRTases из L.delbrueckii, L. gasseri и L. johnsonii . Чтобы связать генотип upp с наблюдаемым фенотипом 5-FU ^s , с использованием двухэтапной схемы замещения аллелей на основе pORI была сконструирована делеция 315 п.н. в рамке считывания в предполагаемом гене upp длиной 630 п.н. (см. Материалы и методы). После размножения хромосомного интегранта L. acidophilus pTRK934 в неселективной среде для облегчения второй гомологичной рекомбинации 1200 колоний были проверены на рекомбинанты Em ^s , которые потеряли остов плазмиды.Из 13 выделенных колоний Em ^s , 4 несли удаленный аллель Δ upp , что подтверждено анализом ПЦР и секвенированием ДНК целевого локуса. Все четыре мутанта Δ upp были способны расти на SDM в присутствии 100 мкг / мл 5-ФУ, концентрация, которая подавляет рост дикого типа. Этот результат подтвердил, что LBA0770 кодирует функциональную UPRTase в NCFM. Все мутанты Δ upp не показали видимых различий в скорости роста по сравнению с родительским штаммом NCFM, когда они культивировались в бульоне MRS (данные не показаны), что указывает на то, что делеция в локусе upp не влияла на рост. поведение мутантов Δ upp .Один из мутантов Δ upp , обозначенный NCK1909, был выбран в качестве фонового хозяина для контрселективной замены гена.

Сравнительные профили экспрессии генов NCFM и Δ upp мутанта NCK1909, выращенного в среде MRS

Конструирование вектора интеграции на основе pORI. Вектор pORI28 был выбран в качестве основы для создания вектора интеграции с возможностью обратного отбора. из-за его установленной эффективности для создания хромосомных вставок и делеций в NCFM.Предыдущий анализ транскриптома NCFM, выращенного на различных источниках углеводов, показал, что ген upp был высоко экспрессирован во всех экспериментальных условиях (10). Следовательно, нативный промотор upp использовали для конститутивной экспрессии эктопического гена upp . Ген lacZ ‘из pUC19 также был включен в вектор интеграции, который содержит обычную MCS и обеспечивает скрининг сине-белого цвета для облегчения отбора рекомбинантов E. coli .

Чтобы сконструировать вектор контрселективной интеграции, всю область множественного клонирования pORI28 удалили рестрикцией BglII и XbaI, затупили концы и лигировали с продуктами SOE-PCR P- upp и lacZ ‘гена с его вышележащий промотор и сайт связывания CAP амплифицированы из вектора pUC19 (рис. 1). Секвенирование полученного вектора интеграции, pTRK935, неожиданно показало присутствие интактного сайта XbaI и пяти дополнительных случайных оснований в месте лигирования между lacZ ‘и остовом pORI28, предположительно в результате обработки тупым концом расщепленного pORI28.Таким образом, сайт рестрикции XbaI в области множественного клонирования pTRK935 не функционирует как уникальный сайт для клонирования гена. Когда pTRK935 вводили в NCK1909, несущий вспомогательную плазмиду pTRK669 (NCK1910), не наблюдалось роста в присутствии 100 мкг / мл 5-FU. Этот результат подтвердил, что P- upp в плазмиде способен дополнять генотип Δ upp в хозяине интеграции NCK1910 и восстанавливать чувствительность к 5-FU и что он может служить функциональным маркером для поддержания отрицательной селекции против меродиплоидов. с 5-ФУ.

Анализ последовательности гена slpX . Для оценки эффективности стратегии контрселекции на основе upp был выбран ген slpX для нацеленной делеции. L. acidophilus NCFM имеет два основных гена белка S-слоя: slpA (LBA0169) и молчащий ген slpB (LBA0175) (таблица 3) (32). Наше недавнее профилирование NCFM S-слоя на основе MS-анализа пептидов, полученных из очищенных S-слоев, выявило коэкспрессию белка SlpX, кодируемого slpX , с SlpA (экспрессируемым штаммом дикого типа) и SlpB (экспрессируемым с помощью slpA ). Мутант со вставкой , NCK1377) (см. Таблицу S4 в дополнительном материале).Таким образом, предполагается, что SlpX вносит вклад в комплекс S-слоя в NCFM. Гены slpA и slpB расположены в кластере генов, тогда как slpX находится в удаленном хромосомном локусе. Выведенная последовательность SlpX имела умеренную идентичность последовательности (53%) с последовательностью белка поверхностного слоя из L. acidophilus JCM1038, единственного ортолога SlpX, найденного в базе данных GenBank. Между тем, SlpX имел менее 30% идентичности последовательности с SlpA (26%) и SlpB (24%), и сходство ограничивалось N-концевой и C-концевой областями.Тем не менее, SlpX похож по размеру на SlpA и SlpB (от 46 до 51 кДа), и все три белка S-слоя имеют общие характеристики, такие как предсказанная базовая изоэлектрическая точка ∼9,5 и высокая доля гидрофобных остатков (от 44 до 48%). ) (Таблица 3), которые являются типичными характеристиками белков S-слоя лактобацилл.

Общая характеристика белков S-слоя в L. acidophilus NCFM

Делеция в рамке считывания гена slpX с использованием безмаркерной замены гена контрселекцией на основе upp .Для конструирования делеции в рамке считывания 1356 п.н. (~ 90% гена) в гене slpX , примерно 750 п.н. хромосомные сегменты, фланкирующие обе стороны области-мишени делеции, амплифицировали с помощью ПЦР, соединенных с помощью SOE-PCR. и клонировали в сайты BamHI / SacI pTRK935. Полученная конструкция, pTRK956, была электропорирована в L. acidophilus NCK1910, и трансформанты были отобраны на основе устойчивости к Em и Cm (фиг. 2). Один трансформант pTRK956 был отобран и размножен в бульоне MRS при 42 ° C в присутствии Em в течение 30 поколений для облегчения интеграции pTRK956 в хромосому посредством гомологичной рекомбинации.Затем интегрированную плазмиду отделяли от хромосомы посредством вторичной рекомбинации, пропуская интегрант в бульоне MRS без Em при 37 ° C в течение 50 поколений. Рекомбинанты, не содержащие плазмид, выделяли на SDM с 5-FU с частотой приблизительно 1,4 × 10 ^-3 . Девять из 18 выбранных изолятов 5-FU ^r несли удаленный аллель Δ slpX , тогда как остальные изоляты сохранили аллель дикого типа (рис. 3). Все рекомбинанты Δ slpX были Em ^s , что подтверждает удаление интегрированного остова pTRK956 из хромосомы.Генотип подтверждали секвенированием ДНК. Один из мутантов Δ slpX , обозначенный NCK1962, был выбран для дальнейшего изучения.

ПЦР-скрининг генотипа Δ slpX в случайных колониях, выделенных после отбора 5-ФУ.(A) Генная организация области, окружающей локус slpX . Стрелки указывают расположение праймеров slpX-up и slpX-dw, используемых для анализа ПЦР. Заштрихованная область в гене slpX представляет собой мишень для делеции. Шпильчатые структуры указывают на предполагаемые rho-независимые терминаторы. Хромосомная карта нарисована не в масштабе. (B) ПЦР-анализ колоний 18 отобранных рекомбинантов 5-FU ^r . Ожидаемые размеры ампликонов, генерируемых из генотипов дикого типа и Δ slpX , составляют приблизительно 3.14 кб и 1,78 кб соответственно. Дорожка М, маркер размера ДНК; дорожки с 1 по 18, изоляты 5-FU ^r ; дорожка WT, родительский штамм NCFM (контроль).

Профиль S-слоя мутанта NCK1962. Разложение очищенных белков S-слоя с помощью электрофореза в SDS-полиакриламидном геле (PAGE) подтвердило отсутствие полосы 51 кДа, соответствующей белку SlpX в NCK1962 (рис. 4). Как и ожидалось, мутант экспрессировал только доминантные белки SlpA (46 кДа), хотя и на несколько более высоком уровне, чем штамм дикого типа, исходя из относительной интенсивности полос.Кроме того, не было обнаружено SlpX-специфического пептида для NCK1962 на основании исследований MS пептидов, полученных в результате трипсинолиза очищенных S-слоев (см. Таблицу S4 в дополнительном материале). Эти результаты дополнительно подтвердили, что отсутствие белка SlpX в S-слоях NCK1962 было связано с делецией гена slpX . Между тем, как для штамма NCFM, так и для интегранта NCK1377 общая интенсивность полос экспрессируемых белков S-слоя свидетельствует о том, что SlpX присутствует на значительно более низком уровне в комплексе S-слоя, чем белки SlpA или SlpB.

SDS-PAGE очищенных белков S-слоя из штамма NCFM дикого типа L. acidophilus (дорожка WT), интегранта NCFM slpA NCK1377 (дорожка 1377) и мутанта с делецией slpX NCK1962 (дорожка 1962), использованный для анализа МС. Профиль S-слоя каждого штамма суммирован внизу на основе результатов МС-анализа очищенных белков S-слоя. +, присутствует; -, отсутствует. Слева указаны молекулярные массы стандартных белков (дорожка M).

Фенотип мутанта NCK1962.Чтобы исследовать роль SlpX в ассоциации с S-слоем у L. acidophilus , мы исследовали влияние делеции slpX на морфотип клеток, реакцию на стрессы окружающей среды и свойства клеточной поверхности. Мониторинг роста в среде MRS, основанный на измерении плотности клеток и количества клеток, выявил несколько более медленный рост мутанта NCK1962, чем эталонного штамма NCK1909, а максимальные удельные скорости роста составили 0,43 часа ^-1 (после 9 часов роста) и 0.56 ч ⁻¹ (через 7 ч роста) соответственно (рис. 5). Тем не менее, культуры NCK1962 в конечном итоге достигли конечной плотности клеток, аналогичной плотности культур эталонного штамма. Исследования NCK1962 под микроскопом и с помощью SEM не показали значительных различий в морфологии и внешнем виде клеток по сравнению с NCK1909 (данные не показаны). На основании анализа MATS оба штамма показали высокое сродство (от 80 до 95%) к неполярным растворителям гексадекану и декану (данные не показаны), что указывает на то, что мутант NCK1962 сохранил гидрофобную клеточную поверхность.Кроме того, NCK1962 проявлял основные свойства клеточной поверхности, аналогичные свойствам NCK1909, о чем свидетельствует его более высокое сродство к хлороформу (> 99%), чем к этилацетату (30%).

Рост L. acidophilus NCK1962 и NCK1909 в среде MRS при 37 ° C в условиях окружающей атмосферы. Рост оценивали путем определения оптической плотности и количества клеток (КОЕ / мл).

Когда культуры контрольного штамма NCK1909 и мутантного штамма NCK1962 подвергались воздействию 0.3% свиной желчи в течение 2 часов, мутант имел более высокую выживаемость (23,5% ± 3,9%), чем NCK1909 (2,6% ± 0,8%) (фиг. 6A). Точно так же NCK1962 был более устойчив к обработке 2,5% бычьей желчью; 57,1% ± 12,9% выживших выздоровели, по сравнению с только 4,3% ± 0,7% жизнеспособных клеток NCK1909. С другой стороны, NCK1962 был более восприимчив к SDS, и сильное ингибирование роста наблюдалось при 0,02% SDS (фиг. 6B). Между тем, NCK1962 показал рост, сравнимый с ростом NCK1909 в присутствии Triton X-100.Кроме того, не наблюдалось значительной разницы в выживаемости NCK1962 и NCK1909 при заражении организмов 10% NaCl, 15% этанолом, низким pH (pH 3,0 или 3,5) в присутствии органической кислоты (молочной кислоты) или неорганическая кислота (HCl) или повторяющиеся циклы замораживания-оттаивания (данные не показаны). Два штамма также продемонстрировали сопоставимые способности прикрепляться к эпителиальным клеткам Caco-2 и муцину желудка свиньи in vitro (данные не показаны).

Выживание NCK1962 (мутант Δ slpX ) и NCK1909 (эталонный штамм) после анализов с нагрузкой на стресс.(A) Выживание культур NCK1909 и NCK1962 в ранней логарифмической фазе после воздействия среды MRS с добавлением 0,3% желчи свиньи или 2,5% желчи быка в течение 2 часов при 37 ° C в условиях окружающей атмосферы. (B) Культуры NCK1909 и NCK1962 в ранней логарифмической фазе инокулировали (1% инокулята) в бульон MRS с добавлением SDS или поверхностно-активного вещества Triton X-100, и плотность клеток измеряли через 24 часа инкубации при 37 ° C в условиях окружающей атмосферы. условия. Данные представляют собой средние значения ± стандартная ошибка средних для трех независимых повторов.

ОБСУЖДЕНИЕ

L. acidophilus принадлежит к одной из самых динамичных групп комменсалов среди обширного консорциума микрофлоры, населяющей верхние отделы желудочно-кишечного тракта человека. Сравнительный геномный анализ с другими видами Lactobacillus и исследования транскрипции микрочипов выявили важные особенности генов, которые могут способствовать выживанию, адаптации и колонизации L. acidophilus в сложной кишечной среде (2, 6, 7, 10, 21). , 31, 42).В связи с промышленным значением L. acidophilus в качестве пробиотика и диетического дополнения, обширные исследования также были посвящены прогнозированию ключевых генов, которые играют важную роль в выживании и активности этого организма как в биопроцессорной среде, так и в среде хозяина. Постгеномный анализ L. acidophilus с целью установления функциональных ролей этих генов и связанных регуляторных сетей требует эффективных инструментов генетического обмена, поскольку чаще всего создание нокаутов генов после идентификации представляющих интерес генных мишеней представляет собой основное узкое место. в функциональных геномных исследованиях.

В этом отчете разработка стратегии встречного отбора на основе upp описана для NCFM L. acidophilus с целью повышения эффективности традиционной системы нокаута гена pORI путем обеспечения прямого отбора для свободных от плазмид рекомбинантов с использованием 5-FU. . Ген upp , кодирующий UPRTase (EC 2.4.2.9), участвует в пути восстановления пиримидина, поскольку UPRTase превращает урацил в UMP для биосинтеза нуклеотидов. Удаление upp в NCFM придает устойчивость к 5-FU, подтверждая присутствие функциональной UPRTase.Цитотоксичность 5-FU инициируется превращением 5-FU в 5-фтор-UMP с помощью UPRTase, что приводит к последующему образованию очень токсичного метаболита 5-фтордезоксиуридинмонофосфата (5-FdUMP) (40). Последнее соединение действует как ингибитор тимидилатсинтазы и тем самым предотвращает образование dTMP, необходимого для синтеза предшественника dTTP. У некоторых микроорганизмов 5-FU также может напрямую превращаться в 5-FdUMP тимидинфосфорилазой и тимидинкиназой (3, 36, 37). Предыдущий анализ генома показал, что L.acidophilus NCFM является ауксотрофным по UTP и dTTP (2). Отсутствие генов, кодирующих нуклеозиддифосфаткиназу и нуклеозидтрифосфатаденилаткиназу, необходимых для превращения UDP (из UMP) в UTP, а также тимидинфосфорилазу, может предотвратить образование 5-FdUMP. Поэтому мы предположили, что фенотип NCFM 5-FU ^s , вероятно, обусловлен кумулятивным токсическим действием промежуточных продуктов 5-фтор-UMP или 5-фтор-UDP. Это наблюдение также подразумевает, что, поскольку NCFM не имеет полного пути биосинтеза пиримидина de novo, мутация upp не приведет к значительным различиям в физиологическом поведении и метаболизме урацила между двумя штаммами.Эта гипотеза подтверждается фенотипическим анализом микроматрицы, сравнивающим исходный штамм NCFM и фоновый хозяин Δ upp NCK1909, где не наблюдали фенотипических различий в ответ на pH, осмолиты и исследуемые химические субстраты. Кроме того, микроматричный анализ транскрипции NCFM и NCK1909, выращенных в среде MRS, показал небольшую разницу в глобальных профилях экспрессии генов между этими двумя штаммами. В совокупности эти результаты подтверждают использование хозяина NCK1909 в качестве представителя штамма NCFM дикого типа для фенотипических исследований in vitro и in vivo мутантов, сконструированных с этой системой замены генов.

Для оценки эффективности контрселективного подхода upp в отношении L. acidophilus была использована стратегия нокаута для создания делеции в рамке считывания в гене slpX . SlpX представляет собой секретируемый белок, который недавно был идентифицирован как белок, связанный с комплексом S-слоя в L. acidophilus NCFM. В общем, S-слои представляют собой паракристаллические слои (глико) белковых субъединиц, которые в изобилии присутствуют на поверхности клеток большинства эубактерий и архей (для обзора см. Ссылку 48).S-слои были идентифицированы и охарактеризованы у множества видов Lactobacillus (для обзора см. Ссылку 4). Примечательно, что L. brevis и несколько видов, тесно связанных с L. acidophilus , включая L. crispatus, L. amylovorus и L. gallinarum , относятся к лактобактериям, продуцирующим S-слой, которые имеют несколько S гены, кодирующие белок (16-18, 29). Тем не менее, только белок поверхностного слоя из L. acidophilus JCM1038, который имел умеренное сходство последовательностей с SlpX, был обнаружен в текущей базе данных GenBank (см. Выше).Возникает соблазн предположить, что белок SlpX является уникальным для NCFM, хотя еще предстоит определить, присутствует ли гомолог SlpX у несеквенированных видов, которые имеют S-слои. Для S-слоев были предложены различные роли, в том числе роли детерминант формы клеток, молекулярных сит, слоев, защищающих от адсорбции фагов или хищных бактерий, и слоев, обеспечивающих места закрепления для связанных с поверхностью ферментов, адгезии клеток и распознавания поверхности. Предполагается, что большинство этих функций важны для выживания L.acidophilus в желудочно-кишечном тракте человека и для клеточной коммуникации с иммунными клетками хозяина и эпителиальными клетками слизистых оболочек. Из-за функционального потенциала S-слоев и тесной ассоциации SlpX с SlpA или SlpB, было очень интересно исследовать функциональную роль SlpX в образовании комплекса S-слоев.

Мутация гена slpX не повлияла на морфологию мутанта NCK1962, хотя мутантный штамм показал немного более низкую скорость роста, чем фоновый хозяин NCK1909.Предыдущее исследование van der Mei et al. (50) продемонстрировали, что S-слои придают лактобацилл гидрофобность клеточной поверхности. В настоящем исследовании отсутствие белка SlpX в структуре S-слоя NCK1962 не вызывало значительного изменения гидрофобности или основных свойств клеточной поверхности на основе ее сродства к растворителям. Одно из возможных объяснений состоит в том, что белки SlpX в природе присутствуют на гораздо более низких уровнях, чем SlpA или SlpB, как показал анализ очищенных S-слоев родительского штамма и SlpB-экспрессирующего интегранта slpA NCK1377 (рис.4). Таким образом, отсутствие SlpX в NCK1962 может иметь незначительное влияние на общие гидрофобные и основные свойства клеточной поверхности. Альтернативно, изменение свойств поверхности из-за отсутствия SlpX может быть компенсировано сверхэкспрессией SlpA в мутанте NCK1962.

Никаких серьезных различий между NCK1962 и NCK1909 не наблюдалось, когда они подвергались ряду стрессовых воздействий окружающей среды, таких как присутствие 10% NaCl или 15% этанола или низкий pH.NCK1962 также показал выживаемость, аналогичную NCK1909, после повторной обработки свободным оттаиванием. Эти результаты предполагают, что отсутствие SlpX в комплексе S-слоя не ставит под угрозу способность мутанта справляться с осмотическим стрессом и стрессом этанола или поддерживать гомеостаз pH или физическую целостность после повреждения замораживанием-оттаиванием. Бак и др. (20) недавно показали, что мутант slpA имел значительно сниженную способность прикрепляться к эпителиальным клеткам Caco-2 in vitro. Эти авторы, однако, указали, что наблюдаемый фенотип пониженной адгезии у мутанта slpA также может быть следствием отсутствия поверхностных белков, ассоциированных с S-слоем, которые вносят вклад в адгезию.В настоящем исследовании мутант NCK1962 не показал сниженной способности прикрепляться к эпителиальным клеткам Caco-2 или муцину in vitro. Это означает, что SlpX не принимает непосредственного участия в поверхностной адгезии или что он может играть второстепенную роль как место закрепления для потенциальных факторов адгезии.

Неожиданно отсутствие белков SlpX в комплексе S-слоя мутанта NCK1962 сделало клетки более восприимчивыми к анионному поверхностно-активному веществу SDS, но не к неионогенному поверхностно-активному веществу Triton X-100, чем эталонный штамм.Обычно оба поверхностно-активных вещества оказывают бактерицидное действие, вызывая лизис клеток. Из-за анионных свойств SDS, которые разрушают нековалентные связи в белках, наблюдаемый SDS-чувствительный фенотип NCK1962 мог быть частично обусловлен денатурацией, вызванной SDS, основных поверхностных белков или транспортеров в NCK1962, которые в противном случае были защищены интактным S-образцом. слой с SlpX в NCK1909. С другой стороны, NCK1962 продемонстрировал значительно повышенную толерантность как к биологическим поверхностно-активным веществам, так и к бычьей желчи (бычьей желчи) и свиной желчи, тогда как NCK1909 наблюдалось почти 2-логарифмическое снижение при тех же обработках.Основными органическими составляющими желчи являются соли желчных кислот, холестерин и фосфолипиды (обзор см. В ссылке 11). Соли желчных кислот синтезируются de novo печенью из холестерина, где стероидная часть молекулы конъюгирована либо с глицином (гликоконъюгированным), либо с таурином (тауроконъюгированным) через пептидные связи. Мы предположили, что отсутствие SlpX может повлиять на проницаемость S-слоев. Это потенциально позволило бы увеличить внутриклеточный доступ конъюгированных солей желчных кислот. Возможно, ожидаемое изменение проницаемости SlpX-дефицитных S-слоев в NCK1962 может потенциально позволить более эффективный отток внутриклеточных деконъюгированных желчных кислот.

На данный момент точная роль slpX остается неясной. Более низкое содержание SlpX в S-слоях, выявленное с помощью SDS-PAGE, позволяет предположить, что этот белок является вспомогательным компонентом комплекса S-слоя. Тем не менее, мы пришли к выводу, что SlpX важен для поддержания клеточной целостности и других неизвестных физиологических функций. Это связано с наблюдениями, что инактивация этого белка влияет на скорость роста и толерантность к солям желчных кислот в мутанте NCK1962, а также на его относительную сверхэкспрессию в NCK1377, SlpB-доминантном штамме, в котором отсутствует белок SlpA.Это означает, что SlpX способствует выживанию и пробиотической функциональности в среде GI хозяина. Дальнейшие фенотипические исследования и исследования экспрессии генов в настоящее время проводятся для установления функции SlpX. В совокупности результаты настоящего исследования проливают свет на сложность биологических ролей S-слоев у L. acidophilus .

Мэдлин Гилмер

Мэдлин Гилмер

Я знал с первого семинара, что Mentor UPP — это сообщество, которым я хотел бы окружить себя по мере прохождения студенческих лет. Я установил невероятные отношения и связи с преподавателями, выпускниками, профессорами и другими студентами, приняв участие в этой организации. Существует множество наставников, которые вольются в вас как в студента и члена сообщества.Я так благодарен за Mentor UPP, и я всегда говорю об этом другим студентам-инженерам из Университета Алабамы.

Мэдлин Гилмер, младший

Алора Терри

Алора Терри

Наставник UPP был для меня поистине бесценным опытом. Это дало мне возможность узнать больше о нетворкинге и познакомиться с другими людьми из инженерного колледжа, одновременно получая лидерский опыт в качестве наставника. Членство в Консультативном совете позволило мне расти как молодому профессионалу и укрепило мою уверенность в себе.Кроме того, у меня была возможность завести друзей на всю жизнь, с которыми я надеюсь поддерживать связь после окончания учебы.

Алора Терри, выпускница

Саманта Томас

Сэм Томас

Наставник UPP был потрясающим опытом. Я стал наставником в младших классах и очень сблизился со своими подопечными. Я посетил большинство мероприятий и очень быстро завел новых друзей и знакомых в инженерном колледже. Вскоре после этого я присоединился к консультативному совету и смог озвучить перемены и поддержать эту программу, которая мне понравилась.Мне пришлось работать бок о бок с Нэнси Холмс и Гейл Хауэлл, двумя потрясающими и вдохновляющими женщинами, которые ценили мой вклад и поддерживали меня во всех моих академических начинаниях. Я смог вырасти и развить свои лидерские качества в обстановке, где я чувствовал себя ценным и услышанным. Я рекомендую эту программу каждому инженеру, которого встречаю, и мне так, так, так грустно, что я ухожу. Я надеюсь на лучшее для программы и буду петь ей дифирамбы, куда бы я ни пошел.

Саманта Томас, выпускница

Клинт Смит

Клинт Смит

Я был частью Mentor UPP в течение пяти лет.С первого года обучения я знал, что эта организация позволит мне расти как личности, в академическом, профессиональном и умственном плане. Программа Mentor UPP позволила мне встретиться с людьми из всего инженерного колледжа, и отношения, которые я установил в рамках программы, будут длиться вечно. Передо мной стояла задача расти еще больше и быть лучшим учеником и человеком. Эта программа изменила мой опыт учебы в колледже к лучшему. Мой единственный совет будущим студентам: чем больше вы отдадите себя организации (не только этой, но и любой другой), тем больше преимуществ и опыта вы получите.

Клинт Смит, выпускник

Блэр Батлер

Блэр Батлер

Наставник UPP был для меня таким потрясающим опытом. Он научил меня лидерским качествам, навыкам работы в сети и помог мне установить контакты с другими студентами и выпускниками инженерного колледжа. Фактически, связи, которые я установил через Mentor UPP, привели к тому, что я получил работу после окончания учебы! Я не могу порекомендовать эту программу студентам любого уровня.

Блэр Батлер, выпускница

Кристин Харрис

Кристин Харрис

Благодаря этой программе я не только смог познакомиться со студентами из разных дисциплин, но и подружиться.Эта программа дала мне возможность быть наставником и общаться с другими студентами-инженерами. Членство в консультативном совете также дало мне возможность работать с другими членами, чтобы помочь сформировать направление, в котором движется программа. Это прекрасная возможность, и я рад, что поступил на первый год обучения.

Кристин Харрис, старший